Cortés decidió realizar su segundo viaje y definitivo a Castilla en 1540, con la intención de resolver los numerosos pleitos que tenía. Tras una incursión en Argel en 1541 y visitas a la corte, termina en Sevilla en 1545.

Decide formalizar su testamento ante el escribano Melchor de Portes el 12 de octubre de 1547. En noviembre se traslada a la localidad de Castilleja de la Cuesta, en el Aljarafe sevillano, alojándose en casa del jurado Juan Rodríguez de Medina. El 2 de diciembre, día en el que fallece, otorga un codicilo modificando su testamento. El domingo es enterrado en el monasterio de San Isidoro del Campo.

Detalles del testamento ológrafo, que firma como marqués del Valle [de Oaxaca], título que obtuvo del rey Carlos V en 1529 cuando Cortés regresa a la corte tras la conquista.

Sus restos han variado de ubicación en varias ocasiones. En 1794 se decidió su traslado al Hospital de la Concepción y Jesús Nazareno de México, lugar al que dedica varias de sus mandas testamentarias relacionadas con la construcción y organización del Hospital. En la iglesia anexa al hospital se encuentran sus restos.